2017年，美國(guó) FDA 批準(zhǔn)了首款 CAR-T 細(xì)胞療法上市，人類進(jìn)入細(xì)胞**時(shí)代，CAR-T 細(xì)胞療法在血液類癌癥中取得了很好的臨床效果。

目前，已上市的幾款 CAR-T 療法都是使用的來自癌癥患者自身的自體 T 細(xì)胞，自體細(xì)胞療法的優(yōu)勢(shì)在于能夠在患者體內(nèi)長(zhǎng)時(shí)間發(fā)揮作用，且不產(chǎn)生排異反應(yīng)，但該方法也存在著許多局限性，自體細(xì)胞療法耗時(shí)長(zhǎng)，一些急性白血病患者沒有足夠時(shí)間等待，此外，許多病情嚴(yán)重的患者沒有足夠的 T 細(xì)胞用于工程化改造，也沒有足夠的時(shí)間來等待改造。

因此，許多研究團(tuán)隊(duì)和公司開始致力于開發(fā)同種異體細(xì)胞療法，異體細(xì)胞療法的細(xì)胞來源更多樣，可以是外周血、臍帶血，以及人工誘導(dǎo)多能干細(xì)胞（iPSC）等等，該方法更容易批量生產(chǎn)，耗時(shí)更少，能夠解決自體細(xì)胞療法的多種局限，也就是所謂的“現(xiàn)貨型”細(xì)胞療法。

以現(xiàn)貨型 CAR-T 療法為代表的同種異體 T 細(xì)胞療法，通常使用基因編輯技術(shù)（主要是 CRISPR-Cas9）來敲除 T 細(xì)胞受體（TCR）及其他基因，來避免移植后出現(xiàn)的移植物抗宿主病（GvHD）。

以色列特拉維夫大學(xué)的研究人員在 Nature 子刊 Nature Biotechnology 發(fā)表了題為：Frequent aneuploidy in primary human T cells after CRISPR–Cas9 cleavage 的研究論文。

該研究使用單細(xì)胞 RNA 測(cè)序技術(shù)驗(yàn)證了  CRISPR-Cas9 基因編輯人類原代 T 細(xì)胞后的結(jié)果，檢測(cè)結(jié)果顯示，CRISPR-Cas9 編輯的目標(biāo)基因所在的染色體出現(xiàn)了頻繁的染色體非整倍性（染色體數(shù)目的增加或減少）和染色體截短。

這項(xiàng)研究結(jié)果表明，染色體的非整倍性和截短是 CRISPR-Cas9 切割 DNA 雙鏈后的常見結(jié)果，因此，在使用 CRISPR-Cas9 基因編輯的臨床試驗(yàn)中，尤其是基于 CRISPR-Cas9 的細(xì)胞療法開發(fā)中，應(yīng)當(dāng)特別注意監(jiān)測(cè)和盡量降低這種潛在的嚴(yán)重染色體變異。

2020年2月，CAR-T 之父 Carl June 教授等人在 Science 期刊發(fā)表論文，報(bào)道了頭個(gè)基于基因編輯的 CAR-T 療法**癌癥的人體臨床試驗(yàn)結(jié)果。

該研究通過 CRISPR-Cas9 基因編輯敲除了 T 細(xì)胞上的 TCR 和 PD-1，TCR 蛋白的 α 鏈（TCRα）由 TRAC 基因表達(dá)，該基因位于14號(hào)染色體；TCR 蛋白的 β 鏈（TCRβ）由 TRBC 基因表達(dá)，該基因位于7號(hào)染色體；PD-1蛋白由 PDCD1 基因表達(dá)，該基因位于2號(hào)染色體。

圖片來自 Science 論文【2】

在這篇*新論文中，研究團(tuán)隊(duì)使用 CRISPR-Cas9 基因編輯技術(shù)來敲除人原代 T 細(xì)胞的表達(dá) TCR 和 PD-1 的基因，而且使用了和上述 Science 論文中同樣的 gRNA 來靶向敲除 TCR 和 PD-1。然后使用單細(xì)胞 RNA 測(cè)序來研究編輯后的人原代 T 細(xì)胞的結(jié)果。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，在基因編輯4天后，相當(dāng)比例的原代 T 細(xì)胞出現(xiàn)了染色體異常。具體來說，9%的原代 T 細(xì)胞出現(xiàn)了14號(hào)染色體缺失，1.4%的原代 T 細(xì)胞出現(xiàn)了14號(hào)染色體增加，表達(dá) TCRα 的基因位于14號(hào)染色體。9.9%的原代 T 細(xì)胞出現(xiàn)了7號(hào)染色體截?cái)?/span>，表達(dá) TCRβ 的基因位于7號(hào)染色體。而在編輯的第11天后，仍有0.9%的原代 T 細(xì)胞存在14號(hào)染色體缺失，進(jìn)一步證實(shí)了這種染色體變異的長(zhǎng)期存在。

這項(xiàng)研究表明，染色體非整倍性（染色體數(shù)目的增加或減少）和染色體截?cái)啵?CRISPR-Cas9 基因編輯時(shí)對(duì) DNA 雙鏈進(jìn)行切割后導(dǎo)致的常見后果，因此，在臨床應(yīng)用中，應(yīng)當(dāng)進(jìn)行相應(yīng)的檢測(cè)并盡量使其風(fēng)險(xiǎn)*小化。

此前已經(jīng)有大量研究發(fā)現(xiàn)并證實(shí)，CRISPR-Cas9 基因編輯，由于 Cas9 造成的 DNA 雙鏈斷裂，導(dǎo)致細(xì)胞出現(xiàn)染色體大片段堿基缺失、染色體碎裂、重排等嚴(yán)重染色體異常。這些發(fā)現(xiàn)提醒了我們應(yīng)當(dāng)加強(qiáng)對(duì) CRISPR 基因編輯技術(shù)潛在風(fēng)險(xiǎn)的評(píng)估和監(jiān)測(cè)。

需要指出的是，堿基編輯（Base Editing），能夠在不造成 DNA 雙鏈斷裂的情況下進(jìn)行基因編輯，堿基編輯技術(shù)開創(chuàng)者劉如謙教授創(chuàng)立的 Beam therapeutics，以及國(guó)內(nèi)的貝斯生物等，正在通過堿基編輯技術(shù)開發(fā)通用型細(xì)胞療法，理論上能夠避免 CRISPR-Cas9 基因編輯導(dǎo)致的染色體異常，具有更好的**性。