1．首先以雙抗體之一于碳酸鹽緩沖液中4℃下過夜包被聚苯乙烯等固相，形成固相抗體，洗滌去除未與固相結(jié)合或結(jié)合不緊的抗體后，用小牛血清或牛血清白蛋白等封閉，洗滌去除未結(jié)合的部分及雜質(zhì)。

   2．加入含待測(cè)物的臨床樣本如血清等，溫育一定時(shí)間后洗板；此時(shí)，待測(cè)抗原就會(huì)與固相上特異抗體反應(yīng)而吸附于固相上。

   3．加入酶標(biāo)記的雙抗體之二，溫育一定時(shí)間后洗板；此時(shí)，在固相上即形成雙抗體與特異抗原的夾心產(chǎn)物。

    4．加入酶底物，溫育顯色測(cè)定(圖2—1)。

 

   在該測(cè)定模式中，有兩步溫育和板孔洗滌步驟，如果將上述測(cè)定步驟2和3并為一步，即將待測(cè)樣本和酶標(biāo)抗體同時(shí)加入，從而僅有一步溫育和洗板過程，即為通常所說的“一步法”。*初的雙抗夾心ELISA試劑盒，均采用兩步法。后來，人們?yōu)榱斯?jié)省時(shí)間，簡(jiǎn)化操作步驟，試劑生產(chǎn)廠家逐步推出了“一步法”試劑盒。目前在我們的臨床實(shí)驗(yàn)室中，測(cè)定大分子抗原如HBsAg、。FP和hCG等，基本上都采用一步法。一步法相比于兩步法，雖然操作簡(jiǎn)單‘但有其固有的缺陷，處理不好，對(duì)ELISA測(cè)定結(jié)果有嚴(yán)重影響。

   在通常的兩步溫育洗滌方法中，抗原抗體反應(yīng)將遵循下述規(guī)律，即在**步中加入的待測(cè)標(biāo)本中抗原(Ag)濃度逐步增加時(shí)，將使固相抗體(Ab)與抗原的結(jié)合逐步達(dá)到飽和[(1)式]，這樣當(dāng)隨后加入一定濃度的酶標(biāo)抗體(Ab’)后，a復(fù)合物的形成將直接與在**步中形成的b復(fù)合物相關(guān)[(2)式]，因此，待測(cè)抗原濃度的逐步增加導(dǎo)致了顯色的逐步加深，當(dāng)抗原濃度增加到一定程度時(shí)，反應(yīng)顯色達(dá)到平臺(tái)，而呈S形變化曲線(圖2—2)。

   而一步法雙抗夾心ELISA的反應(yīng)曲線則為鐘形曲線(圖2—3)。也就是說測(cè)定顯色隨著待則標(biāo)本中抗原濃度的增加而升高至一定程度后，測(cè)定吸光度即隨抗原濃度的增加而開始下降直至不顯色，即所謂的“鉤狀效應(yīng)”(hookeHect)，也就是我們?cè)?*沉淀試驗(yàn)中所稱的“帶現(xiàn)象”(zonephen。menon)。一步法的反應(yīng)平衡式如(3)式

    此外，b和c復(fù)合物的增加亦使得“雙抗體夾心復(fù)合物”難以形成。但如果 固相單抗和標(biāo)記單抗采用針對(duì)抗原的不同且空間距離較遠(yuǎn)的決定簇的抗體，即包被使用一種 單抗，酶標(biāo)記使用另一種單抗，同時(shí)充分混勻反應(yīng)液，并適當(dāng)延長反應(yīng)溫育時(shí)間，則可使b，。和 d復(fù)合物減少至*低程度，而大大減輕“鉤狀效應(yīng)”。

   我們?cè)褂帽臼夷艿玫降暮?高濃度(約2mg／m1)HBsAg的血清樣本對(duì)目前國內(nèi)較大的試劑生產(chǎn)廠家的“一步法”HBsAg測(cè)定ELISA試劑盒的“鉤狀效應(yīng)”進(jìn)行了評(píng)價(jià)，盡管大部分有在HBsAg*高濃度下的測(cè)定顯色較次高濃度(1：lo稀釋)顯色要淺的現(xiàn)象，但均未出現(xiàn)該份樣本測(cè)定為陰性的情況。盡管如此，在臨床實(shí)際工作中，仍有可能遇到“鉤狀效應(yīng)”較嚴(yán)重的HBsAg測(cè)定ELISA試劑盒，我們也經(jīng)常聽到基層實(shí)驗(yàn)室同行在這方面的反映。因此，大家還應(yīng)該重視這方面的問題·，當(dāng)發(fā)現(xiàn)測(cè)定結(jié)果明顯與臨床不符或與相關(guān)測(cè)定指標(biāo)互有矛盾，如HBeAg陽性樣本HBsAg測(cè)定為陰性時(shí)，就應(yīng)考慮HBsAg測(cè)定可能存在的“鉤狀效應(yīng)”問題。

   綜上所述，一步法ELISA試劑盒作為迎合臨床實(shí)驗(yàn)室簡(jiǎn)便快速要求的產(chǎn)物，有著巨大的市場(chǎng)，其雖有潛在缺陷，易導(dǎo)致含高濃度待測(cè)物的標(biāo)本檢測(cè)為陰性(假陰性)，但精心的實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)，對(duì)包被和酶標(biāo)記抗體仔細(xì)選擇，完全可以將“鉤狀效應(yīng)”出現(xiàn)的可能性降至*低。此外，建議生產(chǎn)HBsAg，aFP和hCGELISA"一步法”測(cè)定試劑盒的廠家，應(yīng)對(duì)所產(chǎn)的試劑在出廠前對(duì)其“鉤狀效應(yīng)"(hookeffect)進(jìn)行充分的研究，并提醒用戶在使用時(shí)應(yīng)注意之處。

   雙抗體夾心法測(cè)抗原另一個(gè)所需要注意的是類風(fēng)濕因子(RF)的干擾。我們知道，RF是一種抗變性IgG的自身抗體，主要為19S的IgM類抗體，也可見7S的IgG及IgA類抗體。這種自身抗體的特性是其是能與多種動(dòng)物的變性IgG的Fc部分結(jié)合。因此，如果血清標(biāo)本中含有RF，在雙抗夾心ELISA檢測(cè)時(shí)，其即可作為固相抗體和酶標(biāo)抗體(均為IgG)之間的橋接抗原，而產(chǎn)生假陽性反應(yīng)。因此，如果使用抗體的Fab2：或Fab片段作為酶標(biāo)記用抗體，則可避免RF的干擾。