為了規范酶聯**診斷試劑的生產和質量控制，制定本技術指導原則。

   本指導原則適用于應用酶聯**法的第三類診斷試劑（病原微生物）的生產和質量控制，其他類酶聯**診斷試劑參考本指導原則。國家藥品監督管理部門將依據科學技術發展的需要，適時組織修訂。

一、基本原則

（一）酶聯**診斷試劑生產用的各種原料、輔料應當制定其相應的質量指標，并應符合有關法規的要求。

（二）酶聯**診斷試劑的生產企業應具備相應的專業技術人員、儀器設備以及適宜的生產環境，獲得《醫療器械生產許可證》；同時，生產企業應按照《體外診斷試劑生產實施細則（試行）》的要求建立相應的質量管理體系，形成文件和記錄，加以實施并保持有效運行；生產企業還應該通過《體外診斷試劑生產企業質量管理體系考核評定標準（試行）》的考核。

（三）酶聯**診斷試劑在研制時，應當遵循科學、規范的原則，各反應條件的選擇和確定應符合基本的科學原理。

（四）酶聯**診斷試劑生產過程中所用的各種材料及工藝，應充分考慮可能涉及的**性方面的事宜。

（五）生產和質量控制的總體目標：保證試劑使用**、質量穩定、工藝可控、檢測有效。

二、原材料質量控制

（一）主要生物原料

與診斷試劑的質量*密切相關的生物原料主要包括各種生物活性抗原、重組抗原、單克隆杭體、多克隆抗體以及多肽類、**類等生物原科。這類原料可用于包被酶標反應板、標記相關酶（辣根過氧化物酶、堿性磷酸酶等）、中和反應用抗原或抗體、制備校準品（標準品）等。一般應按照工藝要求對這類生物原料進行質量檢驗，以保證其達到規定的質量標準。主要生物原料若為企業自己生產，其工藝必須相對穩定；若購買，其供應商要求相對固定，不能隨意變更供應商，如果主要原料（包括工藝）或其供應商有變更，必須進行原料驗證，并進行補充申報。

主要生物原料的常規檢驗項目一般包括：

1、外觀

肉眼觀察，大部分生物原料為澄清透明的液體，不含異物、渾濁或搖不散的沉淀；或者為白色粉末，不含有其他顏色的雜質；特殊生物原料應具備相應外觀標準。

2、純度和分子量

主要經SDS-PAGE電泳后，利用電泳掃描儀進行分析，也可用其他適宜的方法，如高效液相法等。根據所檢測生物原料的分子量選擇適宜丙烯酸胺凝膠濃度進行電泳。一般情況下，每個電泳道加樣量為5μg，同時用已知分子量標準作參照，采用合適的電泳電流和電泳時間；電泳后的凝膠可用考馬斯亮藍染色或銀染法染色。染色后的凝膠用電泳掃描儀分析原料的純度和分子量。作為診斷試劑用生物原材料，用銀染法染色后，純度一般都要大于90％；用考馬斯亮藍染色后，純度一般都要大于95％。

3、蛋白濃度

蛋白濃度可通過Lowry法、280nm 光吸收法、雙縮脲方法等進行檢測；

4、效價

效價的測定一般根據蛋白含量測定結果，通過倍比稀釋法進行。效價應達到規定的要求。

5、功能性實驗

功能性實驗是指生物原料用于試劑盒實際生產中的情況，一般考查使用該原料的試劑的靈敏度、特異性和穩定性等，并比較其與上批次原料的相關性。

（二）生物輔料

生物輔料指的是在生產過程中作為蛋白保護??用途的一類生物原料，主要包括小牛血清、山羊血清、牛血清白蛋白和酪蛋白等。這些生物原料均應按照《中國生物制品主要原輔材料質控標準（2000年版）》所規定的質量標準要求進行檢驗，達到相應的質量標準后方應用于生產。

生物輔料的供應商同樣要求相對固定，不得隨意變更供應商。

對于小牛血清或山羊血清、牛血清白蛋白以及酪蛋白等，還應進行功能性實驗，即以其為原料配制10％濃度的稀釋液作為樣品，進行酶聯**測定，均不得出現非特異性反應。

對于標記用酶，應在產品的質量標準中明示所使用的標記用酶的名稱（如辣根過氧化物酶、堿性磷酸酶等），同時應根據不同生產廠家的檢定方法和質量標準進行檢驗，酶的純度RZ值（OD403nm/OD280nm）應大于3.0。

（三）化學原材料

參照《中國生物制品主要原輔材料質控標準（2000年版）》分析純級別進行檢驗。主要的檢測指標包括：溶液外觀、一般鹽類檢測、溶液pH值檢測、溶解情況檢、干燥失重的檢測、熾灼殘渣等。

主要化學原材料的供應商要求相對固定，不得隨意發生變更。化學原材料在購入時，原材料的生產商必須提供該批次化學原材料的質量質量保證材料和質量檢驗報告，其質量標準應達到生產所需的質量標準。

（四）其他物料

1、酶標板

（1）外觀

明亮處用肉眼觀察板條的外觀質量。如有欠注、飛邊、骯臟、表面光潔度差，底部有波紋及劃傷等應剔除。

（2）吸附能力和精密性

用一定濃度的正常人IgG包被板條，再用一定濃度的抗人IgG酶結合物吸附，通過顯色反應，雙波長酶標儀（主波長450nm，參考波長630nm）讀數。計算CV值，批內CV≤5％，批間CV≤10％。

2、液體試劑裝量瓶

包括陰陽性對照、樣品稀釋液、洗滌液、酶結合物或酶稀釋液、底物或底物緩沖液等液體組分，均應有相應的裝量瓶，并建立相應的質量控制標準，如不同的液體試劑所用的裝量瓶規格、裝量瓶的顏色、瓶蓋的顏色等。

3、其他材料

包括試劑瓶標簽、粘膠紙、鋁箔袋、襯墊、可密封塑料袋、說明書、干燥劑和包裝外盒等，均應符合相應質量控制標準，如數量、規格等。

（五）企業質控品

企業質控品包括陰陽性參考品的符合率、靈敏度（*低檢出量）、靈敏度、精密性（均一性）等質控樣品，對于定量檢測試劑，還包括線性質控品樣品。如該產品具有國家標準品或參考品，應使用國家標準品（參考品）進行標化；若該診斷試劑沒有國家標準品（參考品），則企業參考品的質量標準不能低于國家藥品監督管理部門已經批復的**家試劑的質量標準。

企業質控品的基質應與診斷試劑的待測樣品的基質基本一致，如待測樣品為血清/血漿，質控品基質也應為血清/血漿。

三、試劑盒各組分的生產

酶聯**診斷試劑盒主要組分的生產包括酶標記物的制備及滴配過程（酶工作液濃度確定）、各種工作溶液的配制、包被酶標反應板、分裝及包裝等步驟；并通過產品的半成品檢定和成品檢定兩個質控過程來完成。

（一）各種工作液的配制

酶聯**診斷試劑研制生產過程中所用的工作液一般包括：包被液、封閉液、陰性陽性對照、樣品稀釋液、洗滌液、酶結合物或酶稀釋液、底物或底物緩沖液、終止液等，對定量檢測試劑，還包括標準品（或校準品）溶液。若陰性陽性對照或其他液體組分涉及生物**性問題，制備時應在相應的生物**實驗室完成。

各種工作液在配制過程中應嚴格按質量標準中的配方進行配制，充分混勻確保液體中的各種成分均勻，同時進行相應的質量檢驗并達到質量標準后，方可使用或者分裝。對于定量檢測試劑，其標準品（或校準品）溶液應該在量值上具有溯源性。

應對配制過程及配制的液體進行的質量控制，主要包括酶結合物的功能性實驗及穩定性；各種溶液的外觀、pH值及電導率的測定等；酶作用的底物應測定在無相應酶的情況下自身顯色的情況，并制定合理的限定指標；終止液應對其終止酶促反應的能力進行測定。

（二）包被酶標反應板

包被前應對酶標反應板進行質量檢驗，如尺寸、外觀、包裝、吸附性能、精密性等，并記錄酶標反應板的批號、數目、標識。酶標反應板經檢驗合格后方能用于包被。不同批號的板條不能混用。

選擇經檢定合格的包被原料（如抗原、抗體等），經一定的方法確定*佳包被濃度和酶結合物工作濃度，按照診斷試劑的生產規程，配制包被緩沖液、封閉液，經檢驗合格后，包被酶標反應板，經干燥后，已包被的酶標反應板用鋁箔紙封閉（內置干燥劑），抽真空后，保存于2?8℃。

應對包被過程進行相應的質量控制，如包被用原料（抗原或者抗體等生物活性原料）的質量檢驗、包被液和封閉液的質控（如配方、外觀、pH）、包被過程的監控（包括包被和封閉的體積、溫度、濕度、時間等）、包被均一性檢驗、干燥過程的監控等。

（三）分裝和包裝

樣品稀釋液、洗滌液、酶結合物或酶稀釋液、底物或底物緩沖液等溶液應嚴格按照質量標準中的量進行無菌處理后再分裝，分裝量的誤差應小于<5%。

分裝及包裝均應按照相應的SOP的要求進行。包裝前，應嚴格檢查試劑盒的品名、批號等，核對各試劑盒各組分的數量，并在關盒前進行復核。

四、質量控制

（一）半成品質量控制

1、半成品抽樣

檢驗人員按試劑的批號，根據抽樣申請單抽取規定數量的半成品各組分，作號標記、待檢。

2、半成品檢驗

利用上一批檢定合格的試劑盒的相應組分，對本批生產出的各種試劑盒組分分別進行檢驗，檢驗結果達到產品的質量標準。

半成品檢驗，一般使用國家標準品（參考品）或經國家標準品（參考品）標化后的質控品。若某類試劑沒有國家標準品（參考品），則使用企業參考品，但該企業參考品的質量標準不能低于國家藥品監督管理部門已經批復的**家試劑的質量標準。

檢測所抽樣的半成品的試劑盒性能，包括陰陽性參考品的符合率、靈敏度（*低檢出量）、精密性等，均應達到相應質量標準的要求，對精密性，一般情況下CV不得高于15％（采用競爭抑制法的診斷試劑CV不得高于20％）。對定量檢測試劑，同時應分析其線性相關系數和校準品檢測結果的準確性。

企業應該具有對每一批試劑的半成品進行穩定性研究。

（二）成品質量控制

產品包裝完成后，質檢人員根據試劑的批號、實際包裝量、抽樣申請單的要求進行抽樣，同時填寫抽樣數量和抽樣日期，并且由抽樣人簽名。抽樣數量應包括檢定用數量和留樣數量。質檢人員同時應檢查相關原始記錄。

每一批酶聯**診斷試劑報批批量*低要求：達到1萬人份/批。

1、檢驗

（1）成品檢驗

一般使用國家標準品（參考品）對成品進行檢驗，并達到質控品的質量要求。若該診斷試劑沒有國家標準品（參考品），則使用企業參考品，但其質量標準不能低于國家藥品監督管理部門已經批復的**家試劑的質量標準。

（2）穩定性試驗

在批放行前，每一批酶聯**診斷試劑需具備穩定性研究資料。