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技術文章

高速臺式離心機在核酸雜化中的工作原理

什么是離心技術
一．概念
生物樣品懸浮液在高速旋轉下，由于巨大的離心力作用使懸浮的微小顆粒（細胞器、生物大分子的沉淀等）以一定的速度沉降，從而與溶液得以分離的一種技術。沉降速度取決于顆粒的質量、大小和密度。主要應用于各種生物樣品的分離和制備。
二．基本原理
1．離心力（F）
F = m?a ＝ m?ω2r2
a：粒子旋轉的加速度 m：粒子的有效質量克為單位
ω：粒子旋轉的角速度弧度/秒為單位 r：粒子的旋轉半徑 cm為單位
2．相對離心力（RCF）relative centrifuge force
通常離心力常用地球的引力的倍數來表示，因而稱為相對離心力（RCF）。或者用數字×g來表示，例如：13，000g，則表示相對離心力為13，000。相對離心力指在離心場中，作用于顆粒的離心力相當于地球重力的倍數，單位是重力加速度g（980cm/s2）。

RCF=ma/ mg= mω2r2/mg=ω2r2/g
ω=2π×rpm/60
∴RCF=1.119×10－5×（rpm）2r

rpm：revolutions per minute為每分鐘轉數
由上式可??，只要給出旋轉半徑r，則RCF和rpm之間可以相互換算。
由于轉頭的形狀及結構的差異，每臺離心機的離心管從管口至管底的各點與旋轉軸之間的距離是不一樣的，所以在計算時規定旋轉半徑均用平均半徑rav代替：
rav＝（rmin＋rmax）/2

三．離心機的主要類型和構造
1．離心機的分類
工業用離心機

制備性離心機：分離各種生物材料、分離的樣品量比較大
實驗用離心機
分析性離心機：研究純的生物大分子和顆粒的理化性質，一般有光學系統，可監測粒子在離心場中的行為，能推斷物質的純度、形狀和分子量等，都是超速離心機
制備性離心機分為：
（1）普通離心機
*大轉速6000rpm左右，*大RCF接近6000g，容量為幾十毫升至幾升，分離形式是固液沉降分離，其轉速不能嚴格控制，通常不帶冷凍系統，室溫操作，用于收集易沉淀的大顆粒物質，如：細胞等
（2）高速冷凍離心機
轉速為2000－25000rpm，*大RCF為8900×g，*大容量可達3L，一般都有制冷系統，以消除高速旋轉轉頭與空氣之間摩擦而產生的熱量，離心室的溫度可以調節和維持在0℃－4℃，可以嚴格準確的控制轉速溫度和時間，并有指針或數字顯示。通常用于微生物菌體、細胞碎片、大細胞器、硫酸銨沉淀和**沉淀物等的分離純化工作，但不能有效地沉降病毒、小細胞器、或單個分子。
（3）超速離心機
轉速可達50000－80000rpm，RCF*高可達510000×g，離心容量由幾十毫升至2升，分離形式為差速沉降分離和密度梯度區帶分離，需嚴格配平（誤差<0.1g）。可分離亞細胞器、病毒、核酸、蛋白質和多糖等。
2．轉頭
（1）角式轉頭
角式轉頭是指離心管腔與轉軸成一定傾角的轉頭。一般有4－12個裝離心管的離心管腔，離心管腔的中心軸與旋轉軸之間的角度在20°－40°之間，角度越大沉降越結實，分離效果越好。
壁效應：顆粒在沉降時先沿離心力方向撞向離心管，然后再沿管壁滑向管底，因此管的一側就會出現顆粒沉積，此現象稱為“壁效應”。
（2）蕩平式轉頭
吊籃式
（3）區帶轉頭
（4）垂直轉頭
（5）連續流動轉頭
3．離心管
（1）制作材料
塑料：聚乙稀（PE）,聚碳酸酯（PC），聚丙烯（PP），PP性能較好
優點：透明或半透明，硬度小，可用穿刺法取出梯度。
缺點：易變形，抗有機溶劑腐蝕性差，使用壽命短
不銹鋼：
優點：強度大，不變形，能抗熱、抗凍、抗化學腐蝕。
避免接觸腐蝕性的化學藥品，如：強酸，強堿等。
（2）離心管蓋
離心前必須蓋嚴，配平時需帶管蓋重量
管蓋作用：
① 防止樣品外泄
② 防止樣品揮發
③ 支持離心管，防止離心管變形
四．制備性超速離心的分離方法
1．差速沉降離心法
*普通的離心法，采用逐漸增加離心速度或低速、高速交替進行離心，使不同的離心速度及不同離心時間下分批分離的方法，此法一般用于分離沉降系數相差較大的顆粒。
差速離心首先要選擇好顆粒沉降所需的離心力和離心時間。當以一定的離心力在一定的離心時間內進行離心時，在離心管底部就會得到*大和*重顆粒的沉淀，分出的上清液在加大轉速下再進行離心，又得到**部分較大較重顆粒的沉淀及含較小和較輕顆粒的上清液，如此多次離心處理，即能把液體中的不同顆粒較好地分離開。此法所得的沉淀是不均一的，仍雜有其它成分，需經過2～3次的再懸浮和再離心，才能得到較純的顆粒。
此法主要由于組織勻漿液中分離細胞器和病毒，
其優點是：操作簡易，離心后用傾倒法即可將上清液與沉淀分開，并可使用容量較大的角式轉子。
缺點是：須多次離心，沉淀中有夾帶，分離效果差，不能一次得到純顆粒，沉淀于管底的顆粒受擠壓，容易變性失活。
2. 密度梯度區帶離心法（簡稱區帶離心法）：
區帶離心法是將樣品加在惰性梯度介質中進行離心沉降或沉降平衡，在一定的離心力下把顆粒分配到梯度中某些特定位置上，形成不同區帶的分離方法。
此法的優點是：①分離效果好，可一次獲得較純顆粒；
②適應范圍廣，能象差速離心法一樣分離具有沉降系數差的顆粒，又能分離有一定浮力密度差的顆粒；
④ 顆粒不會擠壓變形，能保持顆粒活性，并防止已形成的區帶由于對流而引起混合。
此法的缺點是：①離心時間較長；
⑤ ②需要制備惰性梯度介質溶液；
⑥ ③操作嚴格，不易掌握。
密度梯度區帶離心法又可分為兩種：
（1）差速區帶離心法：當不同的顆粒間存在沉降速度差時（不需要像差速沉降離心法所要求的那樣大的沉降系數差）。在一定的離心力作用下，顆粒各自以一定的速度沉降，在密度梯度介質的不同區域上形成區帶的方法稱為差速區帶離心法。此法僅用于分離有一定沉降系數差的顆粒（20%的沉降系數差或更少）或分子量相差3倍的蛋白質，與顆粒的密度無關，大小相同，密度不同的顆粒（如線粒體，溶酶體等）不能用此法分離。
離心管先裝好密度梯度介質溶液，樣品液加在梯度介質的液面上，離心時，由于離心力的作用，顆粒離開原樣品層，按不同沉降速度向管底沉降，離心一定時間后，沉降的顆粒逐漸分開，*后形成一系列界面清楚的不連續區帶，沉降系數越大，往下沉降越快，所呈現的區帶也越低，離心必須在沉降*快的大顆粒到達管底前結束，樣品顆粒的密度要大于梯度介質的密度。梯度介質通常用蔗糖溶液，其*大密度和濃度可達1.28kg/cm3和60％。
此離心法的關鍵是選擇合適的離心轉速和時間
（2）等密度區帶離心法：離心管中預先放置好梯度介質，樣品加在梯度液面上，或樣品預先與梯度介質溶液混合后裝入離心管，通過離心形成梯度，這就是預形成梯度和離心形成梯度的等密度區帶離心產生梯度的二種方式。
離心時，樣品的不同顆粒向上浮起，一直移動到與它們的密度相等的等密度點的特定梯度位置上，形成幾條不同的區帶，這就是等密度離心法。體系到達平衡狀態后，再延長離心時間和提高轉速已無意義，處于等密度點上的樣品顆粒的區帶形狀和位置均不再受離心時間所影響，提高轉速可以縮短達到平衡的時間，離心所需時間以*小顆粒到達等密度點（即平衡點）的時間為基準，有時長達數日。
等密度離心法的分離效率取決于樣品顆粒的浮力密度差，密度差越大，分離效果越好，與顆粒大小和形狀無關，但大小和形狀決定著達到平衡的速度、時間和區帶寬度。
等密度區帶離心法所用的梯度介質通常為氯化絕CSCl，其密度可達1.7g/cm3。此法可分離核酸、亞細胞器等，也可以分離復合蛋白質，但簡單蛋白質不適用。
收集區帶的方法有許多種，例如：
（1）用注射器和滴管由離心管上部吸出。
（2）有針刺穿離心管底部滴出。
（3）用針刺穿離心管區帶部份的管壁，把樣品區帶抽出。
（4）用一根細管插入離心管底，泵入超過梯度介質*大密度的取代液，將樣品和梯度介質壓出，用自動部分收集器收集。
五．離心操作的注意事項
1．配平
2．裝載溶液的量：不得裝過多液體，以防離心時甩出，造成轉頭不平衡、生銹或被腐蝕
制備性超速離心機的離心管，要求必須將液體裝滿，以免塑料離心管的上部凹陷變形。
3．低溫離心：預冷
4．離心過程不得隨意離開，應隨時觀察
5．嚴格按照轉頭的*高允許轉速和使用累計期限要求操作
6．若轉頭有蓋子，一定蓋上

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